Обсудить на форуме Помощь проекту

Создан инструмент корректирования генома по буквам

07.12.2017
от

Редактирование геномов на базе системы CRISPR-Cas9 продолжает свое триумфальное вторжение в нашу жизнь. На наших глазах рождается технология точечного редактирования оснований — отдельных букв нашего генома. Возможно, именно ей предстоит стать основной рабочей лошадкой медицинской генетики будущего. Дмитрий Лебедев 30.11.2017 ТЕХНОЛОГИИ Грубо говоря, жизнь — это воспроизведение неточно самокопирующихся систем. И неточность тут так же важна, как и копирование: ошибки наследования делают живые организмы разными, а значит дают кому-то из них шанс на «апгрейд» приспособленности к условиям окружающего мира, постоянно подбрасывая эволюции новый материал для отбора. Но то, что хорошо для живого в целом, не всегда хорошо для конкретного организма — особенно если он обременён разумом и амбициями. Изменчивость, в особенности мутационная, частенько наделяет нас помимо нашей невыносимой неповторимости ещё и некоторыми наследственными заболеваниями. Особенно заметно это на примере точечных мутаций, которыми в основном и отличаются друг от друга наши геномы. Перед тем, как продолжить, давайте устроим себе короткий экскурс в молекулярную биологию. Каждая из двух цепей спирали ДНК состоит из нуклеотидов. Самая важная для хранения информации часть нуклеотида — его азотистое основание. Всего этих оснований четыре штуки: аденин (А), тимин (Т), гуанин (Г) и цитозин (Ц). Эти основания из двух разных цепей развёрнуты к центру двойной спирали, где аденин дополняет тимин (и наоборот), образуя с ним пару А-Т; подобные же отношения связывают и гуанин с цитозином, формирующих пару Г-Ц. Именно этой азбукой и записывается информация об аминокислотной последовательности всех белков нашего организма. В коллаже использованы иллюстрации chromatos / Фотодом / Shutterstock Из-за самых разных факторов — от обычного теплового движения до рентгеновского излучения и веществ-мутагенов — основания могут отрываться или изменяться химически. Обычно клеточная ремонтная бригада — система репарации — отлично справляется со своей работой и быстро восстанавливает повреждённое или оторванное основание, используя в качестве шаблона вторую, комплементарную цепь. Однако время от времени ферменты системы репарации допускают ошибки. Как результат — в геноме происходят точечные замены оснований. Из-за них и возникают хорошо известные генетикам однонуклеотидные полиморфизмы или SNP (сокр. от single nucleotide polymorphism) — «однобуквенные» различия между последовательностями нуклеотидов у отдельных индивидуумов. Именно на их долю приходится 90% наших генетических отличий друг от друга. Подавляющая часть точечных мутаций никак не сказывается на добром здравии организма. Большинство из них приходится на эгоистичные и повторяющиеся последовательности генома, которых у нас абсолютное большинство. Кроме того, наш генетический код триплетен, то есть каждая аминокислота кодируется тремя буквами-нуклеотидами и вырожден — то есть каждой аминокислоте соответствует набор из нескольких триплетов. Как следствие, далеко не каждая нуклеотидная замена приводит к аминокислотной замене в структуре белка. И, естественно, не любая аминокислотная замена приведёт к полной поломке белка или драматическому изменению его активности. Но если такая мутация всё-таки влияет на функциональность белка — последствия могут быть самыми серьёзными. Взять ту же самую серповидно-клеточную анемию, (да-да, ту самую, что помимо кучи проблем придаёт своим носителям ещё и устойчивость к малярии). У её невезучих обладателей в седьмом кодоне гена β-глобина аденин заменён на тимин. Единичная А-Т мутация приводит к тому, что глутаминовая кислота, стоящая в 7-м положении гемоглобина, меняется на валин. Молекулы такого дефектного гемоглобина — его называют гемоглобин S или HbS — легко слипаются друг с другом, образуя длинные тяжи, искажающие форму эритроцитов. Такие серповидные эритроциты живут намного меньше своих нормальных двояковогнутых братьев, практически неспособны переносить кислород, а также полностью теряют свою упругость, из-за чего-то и дело застревают в мелких капиллярах, приводя к их закупорке. Серповидно-клеточная анемия — самый распространённый, но, к несчастью, не единственный пример наследственного заболевания связанного с точечными мутациями. С однонуклеотидными мутациями ассоциирован ещё множество других наследственных заболеваний, включая целый набор анемий, некоторые формы болезней Альцгеймера и Паркинсона, и даже такие чудовищные, но, к счастью, сравнительно редкие патологии, как прогерия (преждевременное старение) и фатальная семейная бессонница. Поскольку все эти заболевания связаны с точечными мутациями в единичных генах, исправив сломанный ген, мы можем исправить и проблему, вылечив пациента или как минимум существенно облегчив его положение. Только для этого нам нужен специальный эффективный редактор азотистых оснований, способный работать в живом человеке. На этом месте наш просвещённый читатель наверняка воскликнет: А чего тут изобретать-то! У нас же есть CRISPR-Cas9! И будет по-своему прав. Известнейшая ферментная система, о которой сейчас не говорит только ленивый, действительно в большинстве случаев может исправлять точечные мутации. Но делает она это довольно рискованно — разрезая спираль ДНК по обеим цепям. Такое серьезное повреждение ДНК активирует сразу две системы репарации ДНК. Первая — система гомологичной рекомбинации. Она восстанавливает целостность ДНК, используя в качестве образца неповреждённую последовательность, максимально похожую на повреждённую. При этом мы можем подсунуть клетке в качестве шаблона нужную нам, отредактированную последовательность, и она восстановит разорванный участок так, как нам это нужно. Вот, собственно, чего мы добиваемся. Но тут всё не заканчивается — параллельно пойдёт крайне вредный для нас процесс негомологичного соединения концов, во время которого края разорванной ДНК будут соединены друг с другом случайным образом. При этом могут быть слиты воедино вообще, никак друг с другом не связанные куски ДНК, что приведёт к перетасовке фрагментов ДНК между хромосомами. Конечно, тут клетку можно понять — двуцепочечный разрыв ДНК — дело серьёзное, и нужно срочно принимать какие-то меры, пусть даже и рискованные. Но нас с вами этот опасный побочный процесс совсем не радует, тем более что задача у нас скромная — всего-то заменить один нуклеотид на другой. Может быть здесь можно обойтись и без двуцепочечных разрывов? Определённо, можно. В конце этого ноября команда гарвардских исследователей заявила, что их многолетняя работа наконец увенчалась успехом — они создали с редактор азотистых оснований успешно и безопасно исправляющий пару А-Т на Г-Ц. Тут сам собой возникает вопрос: а с чего это исследователи взялись именно за эту нуклеотидную пару? Не вдаваясь в унылые биохимические подробности, скажу, что химические особенности азотистых оснований делают особенно лёгким именно превращение цитозина в тимин. Это происходит сразу за счёт двух химических реакций — дезаминирования цитозина до урацила и дезаминирования очень распространённого в ДНК 5-метилцитозина до тимина (особенно дотошные читатели могут изучить подробности этих превращений в классическом обзоре). В коллаже использованы иллюстрации chromatos / Фотодом / Shutterstock По этим причинам, конверсия цитозина в тимин стала настоящий горячей точкой мутагенеза — каждый день в каждой клетке нашего тела от 100 до 500 цитозинов спонтанно превращаются в тимины. Целых 48% всех SNP-патологий человека возникают по причине превращения пары Г-Ц в А-Т! И, соответственно, могут быть исправлены обратной конверсией. Поэтому безопасный и надёжный молекулярный редактор, переписывающий А-Т в Г-Ц — давняя и вожделенная мечта учёных и врачей-генетиков. Для создания белка-редактора был использован традиционный для биоинженерии подход. Две белковых последовательности соединили вместе гибким переходником в химерную конструкцию. За основу был взят фермент аденин-деаминаза TadA кишечной палочки, умеющий отрезать аминогруппу от азотистого основания аденина. К нему через гибкий переходник длиной в пару десятков аминокислотных остатков пришили уже знакомую нам Cas9, только лишённую каталитической функции. Такая версия Cas9, так же как и нормальная версия нуклеазы, распознаёт место своей посадки на ДНК с помощь гидовой-РНК, но ни на какие двуцепочечные разрывы не способна, поэтому её обозначают dCas9 (от dead — мёртвый). Задумка учёных была довольно очевидна — dCas9 наводится на место редактирования гидовой РНК, притаскивая с собой аденин-деаминазу. Деаминаза отщепляет от аденина из А-Т пары аминогруппу, превращая его в азотистое основание инозин. В норме инозин не встречается в ДНК, и распознаётся системами репарации как гуанин. Таким образом мы получаем некомплиментарную пару И~Т, которая в ходе репарации и следующего раунда репликации меняется на традиционную и желаемую нами Г-Ц. Изображение: Анатолий Лапушко / chrdk. Нужно признать, что большинство ферментов, связанных вместе и ставших частью химеры, стремительно снижают свою активность. Не обошла эта судьба и нашу деаминазу. Биоинженерная конструкция работала очень плохо, поэтому для её совершенствования было проведено множество раундов искусственной эволюции. Для этого учёные вносили различные варианты генов белка-редактора в культуру бактерий, выращиваемых на среде с антибиотиком. При этом у бактерий так же были гены устойчивости к антибиотикам, но они были почти полностью заблокированы однонуклеотидными мутациями. По задумке ушлых учёных — чем активнее работала белковая химера-редактор, тем большее преимущество получала её бактерия-носитель, вновь активируя с её помощью жизненно необходимые гены резистентности к антибиотику. Так, отобрав самые быстро растущие колонии бактерий, из них можно было выделить гены наиболее эффективных белков-редакторов. Таким манером примерно за год неутомимые гарвардские учёные вместе со своими одноклеточными коллегами запилили аж несколько десятков белков-редакторов, каждый — со своими особенностями работы. Оставалось лишь выбрать тот, что больше всего подходил для работы на человеческих клетках и проверить его в действии. Это было сделано на культурах клеток человека, в которых полученная система бойко исправляла однонуклеотидные мутации, ответственные за развитие наследственного гемохроматоза и персистенции фетального гемоглобина с эффективностью 28% и 29%. На первый взгляд, эти цифры не слишком впечатляют, даже в сравнении с предыдущими достижениями гарвардской команды. Но главное другое — ни одним из методов не удалось выявить случаев ложного срабатывания редактора. То есть молекулярный механизм оказался ещё и точным — по-видимому, в корректируемые матрицы не была внесена ни одна новая мутация. Всё это говорит о крайней безопасности метода, и делает его предпочтительным для решения медицинских задач, связанных с исправлением точечных генных полиморфизмов. Так уж получилось, что жизнь может преуспеть лишь постоянно изменяя свою форму. В дикой надежде угадать нужды завтрашнего дня эволюция создаёт тысячи генных вариантов без оглядки на цену, которую, возможно, придётся заплатить их носителям. Единственная нуклеотидная замена в неподходящем месте легко перечеркивает наши планы, здоровье и саму жизнь. Но времена меняются. Прямо сейчас создаются фантастические молекулярные инструменты, которые очень скоро позволят обжаловать даже самые суровые генетические приговоры

https://chrdk.ru/tech/single-nucleotide-repairs#hcq=xBbk7Dq

comments powered by HyperComments

Написать ответ

Yandex