На сайте elementy.ru вышла интересная статья, где подведены итоги первого десятилетия изучения CRISPR.


Главные новости дня читайте в нашем паблике Вконтакте

 

10 лет назад вышла статья научной группы датской пищевой компании Danisco, в которой было доказано наличие приобретенного иммунитета у прокариот и продемонстрирована его работа на основе транскриптов CRISPR. За это десятилетие приобретенный иммунитет бактерий и архей из разряда экзотических явлений в мире микробов перешел в разряд их неотъемлемых свойств. Исследования показали, как он мог сформироваться в ходе эволюции, каково разнообразие молекулярных инструментов у CRISPR-иммунитета и главное — как его можно использовать. Потенциал микробиологического и лечебного использования молекулярных инструментов CRISPR поистине огромен, хотя недавние работы показывают, что для клинических целей они, безусловно, требуют доработки.

10 лет назад Родольф Баррангу (Rodolphe Barrangou) и Филипп Хорват (Philippe Horvath) с коллегами установили, что система CRISPR у прокариот связана с приобретением иммунитета (см. R. Barrangou et al, 2007. CRISPR Provides Acquired Resistance Against Viruses in Prokaryotes). 10 лет — для науки срок совсем небольшой, но и немаленький для бурного революционного начала. По случаю круглой даты Баррангу и Хорват, запустившие эту революцию, опубликовали в журнале Nature Microbilogy обзор истории исследований CRISPR.

Напомним, что #CRISPR-система представляет собой серию палиндромных повторов, между которыми заключаются короткие отрезки вирусной #ДНК — так называемые спейсеры. В эту систему обязательно входят еще и cas-гены (cas расшифровывается как CRISPR-associated — «ассоциированный с CRISPR»). Вся система призвана опознать чужеродную нуклеотидную последовательность и закрепиться на ней. После этого в ход идут нуклеазные ножницы (эндонуклеазы, входящие в Cas, или другие средства, например РНКазы), которые разрезают вирусную ДНК. Враг, таким образом, обезврежен. Но этого мало: у бактерии, пережившей вирусную атаку, в начало кассеты (см. Gene cassette) CRISPR достраиваются новые палиндромные отрезки с вирусными спейсерами. Теперь кусочек ДНК побежденного врага вставлен в бактериальный геном и будет передан потомкам бактерии. Именно так у бактерий и архей организован приобретенный иммунитет. Он постоянно обновляется по мере встреч бактериальной клетки с вирусными инфекциями.

В конце 1980-х появились первые сообщения о присутствии в геномах бактерий (кишечной палочки, туберкулезной палочки, а также некоторых цианобактерий) и архей серий палиндромных повторов с короткими вставками между ними. Что это за повторы и зачем они нужны, было совершенно не ясно. Они воспринимались лишь как помеха при сборке фрагментов геномов. В 1990-х, когда стали массово секвенировать («читать») бактериальные геномы, оказалось, что повторы — это не экзотический элемент ДНК отдельных бактерий и архей, а весьма распространенный компонент их геномов.

В 2002 году эти повторы получили название CRISPR, которое, в отличие от прежних предложений (DVR — direct variable repeats, TREP — tandem repeats, LTRR — long tandemly repeated repetitive sequences, SRSR — short regularly spaced repeats, LCTR — large clusters of tandem repeats, SPIDR — spacer interspersed direct repeats), закрепилось в науке. Но функция этих повторов оставалась туманной, пока в 2005 году не вышли работы (одновременно три статьи разных научных групп), в которых утверждалось, что спейсеры напоминают фрагменты вирусных или плазмидных последовательностей. И не просто любых, а тех, с которыми столкнулись исследованные популяции бактерий. Поэтому, как предполагалось в этих статьях, действие CRISPR-систем может быть в чем-то похоже на РНК-интерференцию (подавление экспрессии гена на стадиях транскрипции, трансляции или деградации мРНК), хотя никаких инструментальных аналогов РНК-интерференции среди cas-элементов нет.

За этим последовали работы научной группы промышленной пищевой компании Danisco, которая, в частности, занималась бактериями для изготовления молочнокислых продуктов. Они использовали последовательности CRISPR для различения штаммов бактерий Streptococcus thermophilus (рис. 1), которые применяются для изготовления йогуртов. (Ясно, что CRISPR должны быть высокоспецифичны для штаммов.) Когда данных по CRISPR набралось достаточно, по ним провели кластерный анализ. И вдруг выяснилось, что полученные кластеры палиндромных повторов соотносятся с устойчивостью к различным вирусным инфекциям! И, что важнее, у бактерий, которые подверглись вирусной атаке, обнаруживаются дополнительные спейсеры с палиндромными отрезками. В начале 2000-х уже использовали штаммы, резистентные к литическим фагам. После сравнения штаммов, которые использовались в промышленности в 1980–90-е годы, с их резистентными потомками из 2000-х стало ясно, что именно обеспечивает устойчивость к инфекции. Пазл сложился: спейсеры CRISPR определяли иммунитет бактериальных штаммов после перенесенной инфекции.

Команда Danisco проверила это предположение в серии экспериментов: штаммы обрабатывали известными фагами и потом сопоставляли нуклеотидные последовательности их геномов. Кроме этого, пробовали включать и выключать разные гены, в том числе и cas. И выяснилось, что, действительно, в CRISPR-кассеты добавляются новые палиндромы с вирусными спейсерами и что cas-гены принимают участие и в формировании новых CRISPR-участков. Они же (в частности cas9) необходимы для распознавания и обезвреживания вирусных агентов. Главные участники приобретенного иммунитета вышли на сцену — палиндромы, вирусные спейсеры и серия генов cas; обрисовался в общих чертах портрет системы CRISPR-Cas, обеспечивающий приобретенный иммунитет у бактерий (см. R. Barrangou et al., 2007. CRISPR provides acquired resistance against viruses in prokaryotes).

Заметим, что, хотя гипотеза об ингибировании вирусной ДНК по типу РНК-интерференции была выдвинута в 2006 году (см. K. S. Makarova et al., 2006. A putative RNA-interference-based immune system in prokaryotes: computational analysis of the predicted enzymatic machinery, functional analogies with eukaryotic RNAi, and hypothetical mechanisms of action), массовые работы по изучению этого явления начались только после 2007 года (рис. 2). Важно было не просто выдвинуть дельную гипотезу, а доказать реальность явления и определить его «колесики и шестеренки». Тогда появляется возможность целенаправленных содержательных исследований. И они не замедлили последовать. Тем более что смысл приобретенного иммунитета потряс научный мир: ламарковское наследование в мире прокариот! эволюционная гонка вооружений у бактерий и фагов! у бактерий предусмотрен специальный механизм для защиты от чужеродных ДНК по типу интерференции у эукариот! Круто!

 

 

Читать полностью: http://elementy.ru/novosti_nauki/433059/Podvedeny_ito..